Biología celular de la infección por rotavirus y astrovirus. Genómica funcional de la interacción virus-célula huésped. Metagenómica viral.

Las gastroenteritis infecciosas agudas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en niños menores de cinco años en los países en desarrollo, con alrededor de mil millones de episodios diarreicos y entre tres y cuatro millones de muertes por año. Agentes virales, tales como rotavirus, astrovirus, calicivirus y adenovirus, son responsables de un buen número de estas gastroenteritis. Recientemente se licenciaron dos vacunas contra por rotavirus, sin embargo, la infección por rotavirus continúa siendo la de mayor impacto, causando aproximadamente 300,000 muertes al año en niños menores de dos años. Por otro lado, la importancia de los otros virus está siendo revalorada a la luz de métodos diagnósticos más sensibles y específicos. Además de esto, en años recientes se han descrito nuevos serotipos de astrovirus que han sido asociados con enfermedades neurológicas, lo cual ha aumentado el interés en su estudio. En la última década el estudio del bacterioma humano ha surgido como un área de gran relevancia para entender diferentes condiciones de salud y enfermedad. Sin embargo, es muy poco lo que se conoce sobre la composición y dinámica del viroma (el componente de virus) del microbioma, y aún menos sobre su posible impacto en el estado de salud y desarrollo infantil.

ROTAVIRUS

Estos virus están formados por tres capas concéntricas de proteína que rodean al genoma viral, el cual está compuesto por once segmentos de RNA de doble cadena. El ciclo de replicación de estos virus se puede dividir en tres fases principales: La unión penetración a la célula huésped; la transcripción y replicación del genoma viral; y la morfogénesis y salida de las nuevas partículas virales. A lo largo de estos procesos el virus toma el control de la maquinaria biosintética de la célula y la utiliza a su favor. Durante todos estos pasos existen interacciones continuas entre las proteínas virales y celulares que son necesarias para dar lugar a una infección productiva. Uno de los principales intereses de nuestro laboratorio es caracterizar estas interacciones, identificando las moléculas celulares y virales que participan en ellas, así como la relevancia de las mismas en diversas etapas de la replicación del virus. Igualmente, estamos interesados en caracterizar los mecanismos a través de los cuales el virus se defiende y contraataca la respuesta antiviral de la célula. Estos estudios deberán mejorar nuestro entendimiento general de la biología y la patogénesis de los rotavirus y contribuir a abrir nuevas avenidas para desarrollar y optimizar las medidas de control contra este agente viral. En particular, las preguntas que estamos interesados en contestar son:

1. ¿Cuál es el mecanismo por el cual los rotavirus entran a células polarizadas y no polarizadas?
2. ¿Cómo y dónde ocurre el ensamble de la capa externa del virus y cuál es el mecanismo de salida del virus de la célula hospedera?
3. ¿Cuál es el mecanismo por el cual los rotavirus se apropian de la maquinaria de síntesis de las proteínas celulares?
4. ¿Cuáles son los componentes de la respuesta inmune innata de la célula a los que se enfrenta el virus y cuáles los mecanismos que utiliza el virus para contrarrestarla?
5. ¿Cuáles son las proteínas celulares que se requieren para una eficiente replicación de los rotavirus?

ASTROVIRUS

Los astrovirus son causa de diarreas en niños, así como en muchas otras especies animales, incluyendo aves de importancia económica. Además de los 8 serotipos clásicos de astrovirus humanos, recientemente se han descrito nuevos serotipos filogenéticamente más parecidos a astrovirus de animales que de humanos. Algunos de estos se han asociado con enfermedades neurológicas. El genoma de estos virus es de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva y codifica para tres poliproteínas que participan en la replicación del genoma y en la formación de las partículas virales. Estas proteínas deben procesarse proteolíticamente por enzimas virales y celulares (caspasas). El procesamiento proteolítico de la capside viral es importante para la liberación del virus de la célula huésped, así como para su entrada a una nueva célula. Nuestro interés actual en estos virus es el identificar el receptor de astrovirus humanos y definir el mapa inmunogénico de la proteína de cápside a resolución atómica mediante anticuerpos que neutralizan la infectividad viral y evaluar el mecanismo de neutralización de estos anticuerpos. En particular estamos interesados en responderlas las siguientes preguntas:

1. ¿Cuál es el receptor para astrovirus aislados de humano?
2. ¿Existe más de un receptor para diferentes cepas de astrovirus humano?
3. ¿Cuál es el papel del sistema proteasoma-ubiquitinación en la replicación de astrovirus?
4. ¿Cuántos y cuál es la localización de los determinantes antigénicos que inducen e interaccionan con anticuerpos neutralizantes?
5. ¿Cuál es el mecanismo por el que el virus se libera de la célula huésped?

EPIDEMIOLOGIA Y METAGENÓMICA VIRAL

Las enfermedades respiratorias y gastrointestinales siguen siendo la causa más importante de morbilidad y mortalidad en niños menores de cinco años tanto en países desarrollados como en desarrollo. Un porcentaje alto de estos padecimientos son de origen viral, sin embargo, a pesar de la importancia que tienen los virus en las infecciones de estos sistemas en los primeros años de vida, el conocimiento de su epidemiología a nivel comunidad es limitado tanto en el país como en el resto del mundo. El desarrollo y la aplicación de métodos de secuenciación masiva de DNA a la detección de patógenos, está modificando nuestro conocimiento acerca de la frecuencia y epidemiología de los agentes virales conocidos, además de que ha permitido la identificación de virus no descritos previamente. Esta tecnología también ha permitido sugerir el concepto de viroma humano, que puede existir en condiciones de salud y enfermedad. Aunque el impacto del viroma en la salud ha recibido menos atención que el microbioma bacteriano, estudios recientes sugieren que también es relevante. Nuestro interés en esta línea de investigaciones caracterizar por secuenciación masiva la composición dinámica del viroma de los tractos respiratorio y gastrointestinal en niños durante los primeros dos años de edad, en condiciones de salud y enfermedad. En particular, esperamos generar conocimiento sobre:

• La asociación de la infección con un patógeno dado y la presencia de síntomas.
• La duración de excreción de los diversos patógenos respiratorios e intestinales en salud y enfermedad.
• La posible presencia de virus nuevos, no identificados hasta ahora.
• La relación que puedan tener las infecciones de los tractos respiratorio e intestinal.
• La dinámica de la presencia viral (bacteriana y eucarionte) en los tractos respiratorio e intestinal de niños en los primeros meses de vida.
• El efecto de la interacción viroma-bacterioma sobre la patogénesis de bacterias y de virus.

Todas las preguntas que nos hemos planteado son abordadas con metodologías de virología clásica, biología molecular, biología celular, bioquímica de proteínas, inmunología, genómica, bioinformática e ingeniería genética, según sea apropiado. Algunas de las técnicas que utilizamos rutinariamente son: cultivo de tejidos, crecimiento y titulación de virus, transfección transitoria de líneas celulares, clonación y secuenciación de genes celulares y virales, sobre-expresión de proteínas virales en sistemas heterólogos (bacterias, células de insecto, células de mamíferos), obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales, silenciamiento de genes por RNA de interferencia y CRISPR/Cas9, análisis proteómicos, ensayos de genómica funcional, etc.