En nuestro grupo estudiamos diferentes aspectos de la biología (molecular y celular) del programa de inicio y desarrollo de un nuevo órgano en la raíz de las leguminosas (frijol), el nódulo, en donde ocurre la fijación biológica del nitrógeno. La nodulación simbiótica es el resultado de un proceso co-evolutivo entre leguminosas y bacterias del género Rhizobium (rhizobia), una adaptación funcional de mecanismos moleculares y celulares de la raíz que da lugar a la formación del nódulo, en donde la bacteria vive intracelularmente. La organogénesis del nódulo es un programa de desarrollo finamente regulado en el que la percepción y transducción de señales son fundamentales. Este proceso es orquestado por las rhizobia a través de moléculas señales (Factores Nod) que son específicamente percibidas, por los pelos radicales. Para que rhizobia pueda colonizar la raíz, es necesario reprogramar el patrón de crecimiento de los pelos radicales. Esto permite la formación de una nueva estructura tipo túnel, el hilo de infección, por donde migran las bacterias hasta la parte cortical de la raíz. La entrada del simbionte y la organogénesis del nódulo requieren de receptores, cambios iónicos, generación de especies de oxígeno reactivas, citoesqueleto, procesos de exocitosis, endocitosis, vascularización, división, diferenciación e infección de las células de la raíz y la diferenciación de rhizobia a bacteroides fijadores de nitrógeno

Nuestro interés se centra en descifrar qué genes participan y qué respuestas celulares se inducen para generar un nódulo. Con este propósito hemos desarrollado y aplicado diversas estrategias experimentales de última generación para contestar nuestras preguntas y lograr nuestros objetivos; esto nos ha permitido hacer contribuciones de frontera. Las líneas de investigación que estamos trabajando son:

  • Análisis funcional de genes de frijol que se expresan en las etapas iniciales de la interacción entre esta leguminosa y rhizobia. Generamos una librería de ADNc de raíces de frijol inoculadas con rhizobia a tiempos cortos. Se secuenciaron y analizaron aproximadamente 2300 ESTs eligiéndose cuatro para su análisis funcional por silenciamiento utilizando ARN interferente y por sobre-expresión. De éstos, dos genes están relacionados con citoesqueleto, uno con transducción de señales y uno con muerte celular. El factor de despolimerización de actina (ADF), es uno de los genes seleccionados relacionados con citoesqueleto. ADF constituye una familia génica en frijol de 8 miembros y el transcrito de uno de ellos se acumula después de la inoculación con rhizobia. Estamos caracterizando funcionalmente este gen en la nodulación.

  • Análisis funcional de las NADPH oxidasas en las etapas tempranas de la nodulación en frijol.Encontramos que en P. vulgaris hay una familia de nueve genes que codifican NADPH oxidasas, de éstos, cuatro se expresan preferencialmente en raíces y nódulos. Hemos silenciado estos genes usando ARN interferente y los hemos sobre-expresado, encontrando que dos de ellos son esenciales en el inicio de la simbiosis. Estamos estudiando la expresión de la región promotora de estos genes en las raíces de frijol.

  • Identificación y caracterización de ligandos del receptor SymRK, transductor de señales durante la nodulación en frijol. Para identificar interactores (ligandos) intracelulares de SymRK, la estrategia en curso, se basa en la generación y análisis de raíces transgénicas de frijol que expresen un receptor quimérico tipo AtCERK-SymRK-cMyc activado en presencia de quitina (ligando-activador de AtCERK). Estamos en proceso de analizar la composición de los complejos protéicos que co-inmunoprecipitan con AtCERK-SymRK-cMyc activado.

  • Detección de EOR (especies de oxígeno reactivas) o ROS (siglas en inglés) y calcio intracelular en los pelos radicales, los hilos de infección y durante la formación del nódulo en frijol. Utilizamos la expresión de sondas moleculares como GFP, que sensan radicales libres, calcio intracelular y cambios en pH, entre otros. Esto permite visualizar y seguir los procesos celulares en tiempo real y con alta resolución en células vivas, mediante microscopía de fluorescencia y confocal.

  • Estudio del citoesqueleto en células vivas de raíces de frijol durante la simbiosis, por medio de microscopía confocal y de dos fotones. El citoesqueleto como una organización compleja que da forma y estructura a la célula lo estudiamos con herramientas moleculares para generar plantas transgénicas y visualizar los elementos del citoesqueleto en alta resolución con enfoques no invasivos. De esta manera analizamos los rearreglos del citoesqueleto de la raíz de frijol, en respuesta a la infección con rhizobia.

  • Análisis de la ruta de endocitosis en pelos radicales de frijol.Una vez identificados los genes de endocitosis-exocitosis que se expresan en pelos radicales, hemos iniciado el análisis funcional, por silenciamiento, de estos genes durante la interacción rhizobia-pelo radical de frijol

  • Análisis bioquímico y funcional del fosfoproteoma de Phaseolus vulgaris durante las etapas iniciales de la interacción simbiótica frijol-rhizobia. Purificamos fosfoproteínas de raíces de frijol tratadas con factores Nod, a tiempos cortos e identificamos por espectrometría de masas 33 fosfoproteínas. Estamos llevando a cabo el análisis de fosforilación in vitro de proteínas seleccionadas y el análisis funcional de los genes respectivos.

Grupo de la M.C. Carmen Quinto

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