La Temperatura de Fusión, Tm, de un oligonucleótido es un valor de crítica importancia. Su determinación más confiable y exacta es empírica[1a], sin embargo, es bastante tediosa[1b].
Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para calcular la Tm para experimentos de PCR, Southerns, Northerns, y para hibridizaciones in situ
Los principales factores que afectan este valor son: concentración
de sales, concentranción de ADN, presencia de agentes
desnaturalizantes (DMSO o formamida), secuencia, longitud y condiciones
de hidridización.
La ecuación mas simple para calcular la Tm está dada
por la Regla de Wallace[2]:
en donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido presentes. Esta ecuación se desarrolló para oligos 'cortos' de 14 a 20 bases que hibridizarían con sus correspondientes complementarios unidos a una membrana con una concentración de NaCl 0.9M
Por ejemplo, la Tm para la secuencia TGCTCA es: 2(1+2) + 4(1+2) = 18 °C.
La naturaleza de la cadena complementaria inmovilizada provee un decremento neto en la Tm observada cuando tanto la sonda como el complementario están libres en solución. Esta variació es de 7 a 8 °C
Otra ecuación familiar[3] para ADN que también es
válida para oligos mayores de 50 nucleótidos en pH's de 5 a
9 es:
En donde M es la concentración molar de cationes monovalentes, XG y XC son las fracciones molares de G y C en el oligo, L es la longitud de la cadena mas corta en el 'duplex', y F es la concentración molar de formamida
Esta última ecuación es la más conveniente por incluir ajustes para dos de los agentes mas comunes que afectan las temperaturas de hibridización : concentración de sales (a pesar de no estar definida cuando M=0) y concentración de formamida
Así, para la secuencia anterior y con M = 0.9, and F = 0 :
Ecuaciones similares se aplican para ARN [4].
_ Referencias
1a. La forma más común para determinar la Tm es utilizando
una 'termo-celda' en un espectrofotómetro de UV. Si la temperatura
se grafica contra la absorbancia, se obtiene una curva con forma de "s".
La lectura
de temperatura tomada a la mitad de esta curva corresponde a la Tm.
1b. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fritsch,
T. Maniatis-2nd ed. Pags 11.55-11.57
2. Wallace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy, R.F.; Bonner, J.;
Hirose, T.; Itakura, K. Nucleic Acids Res. 6, 3543 (1979).
3. Howley, P.M; Israel, M.F.; law, M-F.; Martin,M.A. J. Biol.
Chem. 254, 4876.
4. Las ecuaciones para ARN son :
Y para hibridos de ADN-ARN