Temperatura de Fusión de Oligonucleótidos
(Tm)
Rutina para calcular Tm



      La Temperatura de Fusión, Tm, de un oligonucleótido es un valor de crítica importancia. Su determinación más confiable y exacta es empírica[1a], sin embargo, es bastante tediosa[1b].

      Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para calcular la Tm para experimentos de PCR, Southerns, Northerns, y para hibridizaciones in situ

      Los principales factores que afectan este valor son: concentración de sales, concentranción de ADN, presencia de agentes desnaturalizantes (DMSO o formamida), secuencia, longitud y condiciones de hidridización.

      La ecuación mas simple para calcular la Tm está dada por la Regla de Wallace[2]:

(1) Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

en donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido presentes. Esta ecuación se desarrolló para oligos 'cortos' de 14 a 20 bases que hibridizarían con sus correspondientes complementarios unidos a una membrana con una concentración de NaCl 0.9M

      Por ejemplo, la Tm para la secuencia TGCTCA es: 2(1+2) + 4(1+2) = 18 °C.

      La naturaleza de la cadena complementaria inmovilizada provee un decremento neto en la Tm observada cuando tanto la sonda como el complementario están libres en solución. Esta variació es de 7 a 8 °C

      Otra ecuación familiar[3] para ADN que también es válida para oligos mayores de 50 nucleótidos en pH's de 5 a 9 es:

(2) Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F

      En donde M es la concentración molar de cationes monovalentes, XG y XC son las fracciones molares de G y C en el oligo, L es la longitud de la cadena mas corta en el 'duplex', y F es la concentración molar de formamida

      Esta última ecuación es la más conveniente por incluir ajustes para dos de los agentes mas comunes que afectan las temperaturas de hibridización : concentración de sales (a pesar de no estar definida cuando M=0) y concentración de formamida

      Así, para la secuencia anterior y con M = 0.9, and F = 0 :

Tm = 81.5 + 16.6(log(0.9)) + 41(.17+.33) - 500/6 - 0.62(0) = 17.9 °C.

      Ecuaciones similares se aplican para ARN [4].

_ Referencias

1a. La forma más común para determinar la Tm es utilizando una 'termo-celda' en un espectrofotómetro de UV. Si la temperatura se grafica contra la absorbancia, se obtiene una curva con forma de "s". La lectura de temperatura tomada a la mitad de esta curva corresponde a la Tm.
1b. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / E.F. Fritsch, T. Maniatis-2nd ed. Pags 11.55-11.57

2. Wallace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy, R.F.; Bonner, J.; Hirose, T.; Itakura, K. Nucleic Acids Res. 6, 3543 (1979).

3. Howley, P.M; Israel, M.F.; law, M-F.; Martin,M.A. J. Biol. Chem. 254, 4876.

4. Las ecuaciones para ARN son :

Tm = 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8(XG+XC)2 - 820/L - 0.35F

Y para hibridos de ADN-ARN

Tm = 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8(XG+XC)2 - 820/L - 0.50F



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