Instituto de Biotecnología, UNAM
Secuenciación Automatizada de DNA
Dr Paul Gaytan y MC Jorge Arturo Yañez
 Unidad de Síntesis y Secuenciación
Instituto de Biotecnología, UNAM
Apdo. Postal 510-3 Cuernavaca, Morelos, MEXICO. C.P. 62250
Tel. (+52) 777 329 1712, (+52) 55 5622 1712; Fax. (+52) 777 317 2388
Reglamento del Servicio de Secuenciación de ADN
A partir de enero del presente año, el responsable técnico de proporcionar el servicio de secuenciación es el M. en C. Jorge A. Yañez.

La mecánica de trabajo será la siguiente:
  1. Entregar las muestras en tubos de 200uL para PCR sin anotaciones en la tapa
  2. Las muestras a secuenciar, junto con sus respectivas solicitudes por duplicado serán recibidas estrictamente en el área de secuenciación de 9 a 12 hrs, durante los cinco dias hábiles de la semana. Al momento de la recepción, Jorge les asignará un número confidencial, que les servirá para bajar sus resultados desde www.ibt.unam.mx --> Uso Interno --> Secuenciacion de DNA ; a partir del tercer día hábil posterior a la fecha de solicitud.
  3. Las condiciones en cuanto a pureza y cantidad de las muestras siguen siendo las mismas que se especifican en la solicitud de secuencia ( "bajar" solicitud en PDF)
  4. La única forma de obtener los resultados será con su número asignado a través de la página anteriormente mencionada.

Cualquier duda, aclaración o sugerencia debe ser dirigida al Dr. Paúl Gaytán

Precio de Secuenciación (por muestra)
Usuarios IBT$8.00 USDls
Usuarios UNAM$12.00 USDls
Instituciones Académicas$16.00 USDls
Empresas$20.00 USDls

Secuenciación Automatizada de DNA

Equipo:  Perkin Elmer/Applied Biosystems Modelo 3730 con capacidad para procesar 96 muestras en 4 hs

Metodo: Taq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Fuorescence-Based Sequencing

RESULTADOS: Las secuencias sin editar serán transferidas al sitio ftp "login@132.248.32.1/%2Fcomun/dnaseq" de donde podrás obtenerlos y analizar, editar, e imprimir el texto y/o el electroferograma con el programa EditView   en tu propia MAC, o si lo prefieres puedes hacerlo en Windows PC utilizando Bioedit

No se entregarán datos impresos a color a menos que sean requeridos expresamente por el usuario con un cargo adicional.

La calidad de los resultados de secuencia está directamente relacionado con la calidad del templado, por lo que es de suma importancia seguir los requerimientos específicos para entregar sus muestras.

PREPARACION  DE TEMPLADOS :

  • El DNA plasmídico de doble cadena será preparado, analizado y cuantificado por el propio usuario
  • El metodo de preparación de templado influye directamente sobre la calidad de los resultados mas que algun otro factor.
  • El DNA de Miniprep preparado con columnas de QIAgen y/o  ROCHE (Boehringer) dan buenos resultados.
  • Si el kit incluye reactivos opcionales, utilizarlos para aumentar la calidad de la preparación.
  • NO aplicar calor para secar DNA en el Speed Vac.
  • NO se recomienda utilizar la cepa JM101.
  • Se recomienda utilizar cepas de E.coli DH5-α HB101 y XL1-blue para transformar.


DNA :
(Todas las muestras en agua grado biología molecular)

  • La mezcla DNA/Oligo se puede entregar en un volumen  de 16µL final en un tubo eppendorf de 200µL para PCR
  • Plásmido (3-10kb)  : 500-750ng.
  • Plásmido (10-20kb)  : 1-1.2µg.
  • PCR (1000pb) : 100ng (10 nanogramos de DNA templado por cada 100bp de producto de PCR).
  • Lambda : 1.5 µg total.
  • Cadena sencilla : 20ngµl (100ng).
  • Cósmido : 1µg.
  • Oligo : 10pmol
  • Los insertos de cDNA no se secuencian por el lado 3«con primers universales
  • El DNA debe estar verificado por gel de agarosa y la concentración debe ser checada a 260nm.

    • (ambas condiciones son importantes ya que el DNA puede tener contaminación de DNA genomico o RNA que afectan la A260  por lo que la concentración de DNA plasmidico será sobrestimada)
    Tomando en cuenta que 1 OD a 260nm = 50ng/µL.
    260/280 = (~1.8-2.0)
    230/260 = (0.3-0.6)

    Primers

    La Unidad cuenta con los oligonucleotidos:
    m13/pUC -40 FOR
    		5´-GTT TTC CCA GTC ACG TTG TA-3´
    m13/pUC REV
    		5´-TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTC-3
    T7 PRIMER
    		5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´
    T3 PRIMER
    		5´-CGC ATT TAA CCC TCA CTA AAG-3´
    SK PRIMER
    		5´-CGC TCT AGA ACT AGT GGA TC-3´
    KS PRIMER
    		5´-TCG AGG TCG ACG GTA TCG-3´

    Los oligos internos deben ser de al menos 18 bases con   50% GC (Tm=50 deg) o 24-25 bases (Tm=60 deg). Esto asegura una  mejor calidad de resultados en la secuencia.
    Oligo 5pmol.

    Las muestras NO deben proporcionarse con:

    -Sales (230/260 elevado)
    -260/280 fuera de rango
    -Elevada contaminacion de DNA genómico
    -RNA en más de 1µg
    -Templado que proviene de vectores de crecimiento lento (JM101)
    -Etanol o fenol
    -CsCl en más de 5mM
    -PEG en máas de 0.3%

    Links relacionados:

    1. Tips para medir correctamente la concentración de Oligos, DNA y RNA.
    2. Guía de problemas de Secuencia en capilar
    3. Resumen de operación de secuencia automatizada.  Una guía de la Core Facility de la Escuela de Medicina de Harvard
    4. ABIViewHomepage  del programa para Windows-PC para analizar archivos de ABI
    5. La Core Facility del Instituto Weizmann, Israel.


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