Preguntas Frecuentes Relacionadas con Oligonucleótidos
¿En qué condiciones se entregan los oligos?
La Unidad de Síntesis y Secuenciación entrega los oligos
resuspendidos en agua milli-Q estéril, condiciones que generan un pH
cercano a 5.0. En caso de observar baja solubilidad (dependiente de
algunas secuencias) se recomienda disolverlos en un buffer estéril
a pH 7.0 (p.e. TE)
¿Cómo se deben almacenar los oligos?
Para almacenamiento prolongado, los oligos deben
guardarse en forma liofilizada a -200C. Para experimentos numerosos,
deben ser alicuotados y guardados a 40C. Los oligos NO
deben congelarse y descongelarse repetidamente, ya que este proceso genera
degradación física. El manejo también debe ser
cuidadoso para evitar contaminación bacteriana.
¿De qué manera se cuantifican los oligos? (Ir a Cuantificación)
Los oligos se cuantifican por la medición de su
absorción de UV a 260nm. Un oligo de cadena sencilla, disuelto en
una solución acuosa neutra a una concentración de 33ug/ml
tendrá una absorbancia a 260nm igual a 1.0. La
unidad de densidad óptica (OD) se define como la absorbancia
(a 260nm en una cuveta de 1cm de longitud) multiplicada por el volumen (en
ml). Así, 1 OD es 33ug de DNA de cadena sencilla.
¿Qué datos se proporcionan en mi Reporte de
Síntesis?
La USS proporciona un reporte escrito que incluye: secuencia del
oligo, número de síntesis (importante para posteriores
rastreos, longitud del oligo, rendimiento en OD's,
concentración en pmolas, concentración en ug, peso
molecular, coeficiente de extinción molar y
temperatura de fusión calculada por 2 métodos. En la parte
posterior del reporte se imprime la secuencia que fue programada
directamente en el sintetizador, la fecha de síntesis y las bases
utilizadas
¿Cuál es el rendimiento de la síntesis de oligos?
El rendimiento de la síntesis de oligos está afectado
por muchos factores. La principal razón por la que se
observan distintos rendimientos para el mismo oligo es que las columnas de
síntesis no están cargadas
con exactamente la misma cantidad de soporte (CPG), el material de
inicio. Por ejemplo, una columna de 0.2 umol tendrá un
mínimo de 0.2 umol del nucleósido 3' para iniciar la
síntesis, pero frecuentemente se tendrá mas de esta
cantidad. Recuerde que esta es la cantidad de inicio y no el rendimiento
final. El rendimiento final depende del tamaño del oligo, la
eficiencia de acoplamiento y la composición nucleotídica.
¿Hasta que longitud es posible sintetizar un oligo?
En la USS es posible ensamblar oligos hasta de 80 nucleótidos utilizando una
escala de
0.5 umol. De manera rutinaria se ensamblan oligos de 20-50nt con la escala de 0.2umol.
¿A qué se refieren con "Oligos Crudos"?
Los oligos crudos son aquellos que fueron
desprotegidos con NH4OH concentrado, desalificados por extracción
con n-butanol, secados a vacío y resuspendidos en agua o en
algún buffer acuoso, manteniendo
posibles productos de deleción. Todos los oligos producidos en la
unidad se encuentran en su forma OH-terminal, esto es, no están
fosfatados. La desalificación (ir a Desalificación), es
especialmente importante
para secuenciación por dideoxy, mutagnesis in vitro y
quinación. Los oligos pueden purificarse por diversos
métodos: electroforésis en gel
de poliacrilamida (ir a Purificación),
HPLC de intercambio iónico o fase reversa (en este caso es
necesario solicitar los oligos en su modalidad Tr-ON) o bien por cartucho
de fase reversa (también Tr-ON). Un oligo puro es aquel que ha
sido separado de sus productos de deleción y grupos protectores
remanentes. Se recomienda utilizar los oligos puros para
cristalografía, marcaje, ensayos en geles de retardamiento y
síntesis de genes.
¿Qué método de síntesis se utiliza en la
USS?
Los oligonucletidos convencionales son sintetizados
por el Método de Fosfitotriester, en la dirección 3'->5'.
Particularmente, en la USS se utilizan sintetizadores
automatizados de DNA modelo 391 de Applied Biosystems y
ß-cianoetilfosforamiditos de Glen
Research.
¿Por qué varían los valores de Tm? (Ir a Tm de Oligos)
La temperatura de fusión (Tm) de un oligo depende
de varios factores: longitud, secuencia, contenido G+C,
y el tipo y concentración de los cationes presentes,
particularmente el ión Na+. Hasta el momento se han utilizado
muchas fórmulas para 'predecir' este valor. En la USS se
utilizan las siguientes fórmulas :
1. Tm = (2 * (A+T)) + (4 * (C+G))
2. Tm = 67.5 + 0.34*(%(C+G)) - 395/longitud
La primera se recomienda para oligos menores de 20 bases y la segunda para
oligos que varían de 20 a 100 bases. Una tercera ecuación
incluye factores como concentración de formamida (F) y de cationes
monovalentes (M), es:
y es recomendable para oligos mayores de 50 bases en pH's de 5 a 9.
¿Cómo se determina la temperatura de "annealing" para una
PCR?
Calcule la Tm con la fórmula 'que mas le guste' y reste de 5 a
10°C. Si los dos oligos tienen distintas temperaturas de
fusión, NO promedie los valores, use el menor de ellos para que los
dos oligos puedan hibridar.
En la unidad de sntesis es posible producir
oligofosforotioatos, marcar la terminal 5' con fluorescíena o la
terminal 3' con colesterol. Pero pueden realizarce una gran gama de
marcajes a petición expresa del usuario.
¿Cuánto cuesta un oligo?
El precio de un oligo depende del número de bases que lo
constituyan. En la USS se ofertan a $0.80 USDls por base sin ningún
otro cargo extra. Así, un oligo de 20 bases de longitud
tendrá un costo de : 20 x 0.80 = $16.00 US Dls.