CUANTIFICACION 


Introducción

Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl
Concentración de Oligonucleótido en Unidades O.D.
Concentración de Oligonucleótido en µg/ml
Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.
Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.
Midiendo la Concentración de RNAen µg/ml.


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Introducción :
Cuantificación de Oligonucleótidos y Acidos Nucleicos  por  Espectroscopía de UV

 
    Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de Uv de DNA es una característica  de la molecula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado . Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando se trata de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración.

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Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl

  Los ácidos nucleicos tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm. A esta longitud por lo tanto, la absorción es proporcional a la concentración.
 
C (pmol/µl)= (A260 * 100 * Factor de dilución) / (1.54*nA + 0.75*nC + 1.17*nG + 0.92*nT)

En la fórmula:
   C, es la concentración calculada en picomolas por microlitro (pmol/µl).
   A260 es la absorbancia a 260nm.
   El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por el número de veces que aparece en el oligonucleotido.
   El factor de dilución es igual a el volumen final de la dilución dividido entre la cantidad alicuotada para la dilución.

Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.

  1. Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamineto y seleccionar la longitud de onda a 230 y 260nm
  2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
  3. A 990 µl de agua bidestilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.
  4. Leer la absorbancia a 230 y 260nm de la muestra

NOTA:
   - A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.
   - El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima) está influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra.
 
Ejemplo.

 Se tiene un 21mero con la secuencia 5' CCT CCT GGC CAG GAC TTA TTG A3' . El oligo se diluyó 10µl + 990µl de agua.  Las lecturas de absrbancia a 230nm= 0.132003;  260nm= 0.285736. Cúal es la concentración del oligo?

C = 0.286 x 100 x (1000/10) / (1.54 x 4) + (0.74 x 6) + (1.15 x 5) + (0.87 x 6) 
C = 286/21.57
C = 13.26pmol/µl


      Si se conoce la concentración del oligo en microgramos, se tiene entonces que :

C (picomol) = (microgramos * 1,000,000) / (longitud * 308)


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Concentración de Oligonucleótido en Unidades de Densidad Optica (O.D.'s)

    La cantidad de oligonucleótido tambien se expresa como Unidades de Densidad Optica (O.D.); esto es, la cantidad de Oligo disuelto en 1ml de agua con un valor de A260 igual a 1.00 en una celda de 1cm de longitud, y se calcula por la ecuación:
Unidades O.D.= A260 X volumen del stock X factor de dilución
Para el ejemplo anterior tenemos que la solución stock es de 1.2ml.
Unidades O.D.= 0.286 x 1.2ml x (1000/10µl) = 34.32 O.D.'s

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Concentración de Oligonucleotido en µg/ml

   El valor de A260se convierte a µg/ml usando el coeficiente de extinción para ssDNA la cual es 1ml/33µg para una celda de 1cm  de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la muestra contine 33µg de ssDNA por ml o en la ecuación:
   1unidad de O.D.de ssDNA=33µg

Nuevamente para el ejemplo anterior:
33µg/ml/1.0 O.D. = µg/ml/0.286 = 9.43µg/ml/
Multiplicando por el factor de dilución la concentración en la solución stock
9.43µg/ml/ x (1000µl/10µl) = 943µg/ml

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Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.

    La concentración de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/µl, tomando en cuenta el promedio del peso molecular de un nucleotido en la molecula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons.  (el termino "d alton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atomica del 12C. El cual es utilizado como peso molecular expresado cuantitativamente como  g/mol).

Ejemplo:
      el Bacteriofago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250nucleotidos. Para expresar esto como µg/pmol:
(7250nts)  330µg/mol   x  106µg  x _1mol___      =2.39µg/mol
 nt                g          1012pmol
Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10µl/1000µl y da una lectura de A260 = 0.163, la concentración es:
(xµg/µl) / (0.163) = (33µg/µl) / (1.0 OD)   x= 5.38 µg/µl   multiplicando por (1000 µl/10 µl) = 538 µg ssDNA/ml 
Para convertir a pmol / µl:
(538µg / ml ) (1pmol / 2.39µg )( 1ml / 1000µl ) = 0.225 pmol/µl

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Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.

    Para determinar  la concentración de ssDNA de Alto Peso Molecular, plasmidos o productos de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5µg/ml pueden ser detectadas. A pH neutro, una solución de DNA a 1 mg/ml tiene una absorción máxima a 260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm. (este valor es para moléculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para muchas apli caciones en Biologia Molecular el contenido de G+C no es nescesario considerarlo a menos que sea muy extremo). En principio una soluciòn de dsDNA con una concentración de 50 µg /ml debe tener una A260 i gual a1.0.

  1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml
Ejemplo:  de una solución del plasmido pUC19 se diluyo una alicuota  a razon de 5µl / 1000µl en agua, las lecturas de absorbancia son: 260 = 0.789;  280 = 0.4475
(xµg/ml) / (0.789) = (50µg / ml) / (1.0 OD)  x= 19.74 µg/ml   multiplicando por (1000 µl / 5 µl) = 3948µg dsDNA/ ml
La relación A260 /A280 del dsDNA  es 0.789 / 0.447 = 1.76
 

    Las proteinas tienen un máximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de triptofano) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algun contaminante proteico. El cálculo de la relación A260 /A280 es una manera comun para expres ar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una muestra pura.

    Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260 /A280 puede no nescesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces tambien, una muestra con una  baja relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.

    El metodo mas comun de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol para remover la proteina contaminante. El fenol tiene una absorción maxima a 270nm. Las preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A260  y la concentración de DNA sera sobrestimada.
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Midiendo la Concentración de RNA en µg/ml.

    La concentración de RNA  de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medición de DNA. Sin embargo se aplica la siguiente relación:
 1 unidad A260 de ssRNA = 40µg / ml 
Las preparaciones puras de RNA tienen una relación A260 /A280 de 2.0

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