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Concentración de Oligonucleótido en
pmol/µl
Concentración de Oligonucleótido en Unidades
O.D.
Concentración de Oligonucleótido en
µg/ml
Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.
Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.
Midiendo la Concentración de RNAen µg/ml.
Introducción :
Cuantificación de Oligonucleótidos y Acidos Nucleicos
por Espectroscopía de UV
Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta
debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo
de las cadenas de DNA. La absorción de Uv de DNA es una característica de la molecula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su
propio y único espectro de absorción y por lo tanto
contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de
UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado
. Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando se trata
de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere
determinar correctamente la concentración.
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Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl
Los ácidos nucleicos tiene un máximo de
absorción a una longitud de onda de 260nm. A esta longitud por lo
tanto, la absorción es proporcional a la concentración.
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Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.
NOTA:
- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia
máxima.
- El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda
mínima) está influenciado por la cantidad de sales presentes
en la muestra.
| Ejemplo. Se tiene un 21mero con la secuencia 5' CCT CCT GGC CAG GAC TTA TTG A3' . El oligo se diluyó 10µl + 990µl de agua. Las lecturas de absrbancia a 230nm= 0.132003; 260nm= 0.285736. ¿Cúal es la concentración del oligo?
C = 0.286 x 100 x (1000/10) / (1.54 x 4) + (0.74 x 6) + (1.15 x 5) + (0.87
x 6) |
La cantidad de oligonucleótido tambien se
expresa
como Unidades de Densidad Optica (O.D.); esto es, la cantidad de Oligo
disuelto en 1ml de agua con un valor de A260 igual a 1.00 en
una celda de 1cm de longitud, y se calcula por la ecuación:
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El valor de A260se convierte a µg/ml usando el coeficiente de extinción para ssDNA la cual es 1ml/33µg para una celda de 1cm de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la
muestra contine 33µg de ssDNA por ml o en la ecuación:
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La concentración de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/µl, tomando en cuenta el promedio del peso molecular de un nucleotido en la molecula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons. (el termino "d
alton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atomica del 12C. El cual es utilizado como peso molecular expresado cuantitativamente como g/mol).
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Ejemplo: |
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Las proteinas tienen un máximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de triptofano) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algun contaminante proteico. El cálculo de la relación A260 /A280 es una manera comun para expres ar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una muestra pura.
Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260 /A280 puede no nescesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces tambien, una muestra con una baja relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.
El metodo mas comun de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol para remover la proteina contaminante. El fenol tiene una absorción maxima a 270nm. Las
preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A260 y la concentración de DNA sera sobrestimada.
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La concentración de RNA de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medición de DNA. Sin embargo se aplica la siguiente relación:
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