Instituto de Biotecnologia UNAM

Dr. José Luis Puente García

Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y enterohemorrágica (EHEC), así como Citrobacter rodentium, conforman una familia de patógenos bacterianos que se unen íntimamente al epitelio intestinal y destruyen las microvellosidades, formando lesiones características denominadas de adherencia y esfascelamiento/destrucción ("attaching and effacing" lesions, A/E). EPEC es una de las principales causas de diarrea, particularmente en niños menores de seis meses de edad que viven en países en desarrollo. EHEC es el agente causal de colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico, trastorno secundario que puede ser fatal. Ambas clases representan importantes patógenos para el hombre y siguen causando altos índices de mortalidad y morbilidad alrededor del mundo. C. rodentium es la causa de una enfermedad conocida como hiperplasia del colon transmisible en ratones, caracterizada por la hiperproliferación de las células epiteliales en la parte distal del colon. La capacidad de formar la lesión A/E de estos patógenos la confieren una serie de proteínas codificadas en una isla de patogenicidad denominada LEE ("Locus of enterocyte effacement"). Esta isla se encuentra organizada en al menos cinco operones: LEE1 a LEE5. En los operones LEE1 a LEE3 se encuentran los genes necesarios para la producción de un sistema de secreción tipo III (SSTT); LEE4 codifica para las proteínas translocadoras del SSTT, mientras que en LEE5 se encuentran los genes que codifican para Tir, intimina (eae) y una proteína chaperona de Tir, llamada CesT. Las proteínas efectoras que son translocadas hacia la célula hospedera a través del SSTT son, en parte, las responsables de subvertir procesos celulares en la célula eucariote que dan lugar al fenotipo de adherencia íntima, rearreglos del citoesqueleto y otros fenómenos asociados a la enfermedad. Los genes que codifican para estas proteínas efectoras se encuentran codificadas a lo largo del LEE o en otras regiones del cromosoma. Nuestro interés ha sido entender los mecanismos moleculares que coordinan temporal y espacialmente la expresión de factores de virulencia en estos organismos. El análisis de la regulación de genes codificados en el LEE en EPEC ha permitido establecer un modelo de la cascada reguladora que coordina dicha expresión. Ler, codificado por el primer gen del operón LEE1, regula positivamente la transcripción de los operones LEE2 a LEE5, además de otros promotores dentro y fuera del LEE como espC. Ler acta como un desrepresor que contrarresta el efecto negativo que ejerce H-NS sobre la expresión de estos genes. Ler y H-NS comparten similitudes significativas principalmente a nivel del dominio carboxilo-terminal. H-NS parece formar un complejo ncleo-proteico que impide la interacción de la RNA polimerasa con los promotores o que la atrapa dentro del complejo. En la región reguladora de los operones LEE2 y LEE3, Ler interacta preferentemente con un motivo incluido dentro de una de las secuencias silenciadoras. Así, en condiciones donde Ler alcanza la concentración apropiada compite eficientemente por dicha región, desplazando a o evitando el acceso de H-NS modificando, así, el complejo represor para permitir el inicio de la transcripción. El estudio de estas proteínas es un modelo ideal para entender el papel que juega H-NS en la homeostasis de bacterias patgenas regulando negativamente de la expresión de factores de virulencia en bacterias patógenas. Así mismo, el de reguladores específicos como Ler que han evolucionado para contrarrestar dicha represión en respuesta a señales ambientales, las cuales son encontradas por la bacteria durante el establecimiento de una infección y que actan como marcadores de los nichos que favorecen la proliferación del patógeno. Al ser Ler el regulador más importante, su regulación transcripcional es compleja e involucra reguladores globales también presentes en bacterias no patógenas, tales como IHF, Fis, el regulador de "quorum sensing" QseA, y la GTPasa BipA como moduladores positivos, así como H-NS y Hha como reguladores negativos. Sin embargo, el control de su expresión requiere de elementos reguladores positivos sólo presentes en los organismos A/E. El gen previamente identificado como orf11, codifica para un activador transcripcional denominado GrlA (Global Regulator of LEE Activator) que pertenece a una familia novedosa de reguladores y que a la fecha cuenta sólo con tres miembros. GrlA es esencial para la eficiente activación de los genes de la isla y activa directamente al gen que codifica para Ler, con quien establece un circuito regulador positivo ya que Ler también activa la expresión del operón grlRA. Por su parte, GrlR acta como modulador negativo de la actividad del mencionado circuito Ler-GrlA, a través de interactuar con GrlA, así como de forma independiente reprimiendo, mediante un novedoso mecanismo an no caracterizado en detalle, la expresión de diferentes factores de virulencia. GrlA y GrlR representan también un mecanismo particular de regulación, ya que la función de ambas proteínas depende en buena medida de las condiciones de cultivo y de diferentes tipos de interacciones moleculares.

El estudio sistemático del LEE, además de demostrar que todos los genes del LEE son necesarios para que Citrobacter infecte con eficiencia, también permitió descubrir siete nuevas proteínas secretadas por C. rodentium, cuya secreción depende del SSTT codificado en el LEE, lo cual sugiere que podrían ser proteínas efectoras. Genes que codifican para proteínas homólogas están en los genomas de EPEC y EHEC. Siete de estas proteínas, llamadas NleA, NleB, NleC, NleD, NleE, NleF y NleG ("Non-LEE encoded effector"), están codificadas fuera de la isla LEE en diferentes regiones del genoma que no están presentes en E. coli K-12 (a estas regiones se les llama islas-O). El análisis de dichas islas ha permitido la identificación de genes adicionales que también parecen codificar para proteínas efectoras como NleH. El estudio de los mecanismos que controlan la expresión de estos nuevos efectores, incluyendo su posible co-regulación con el LEE (como sucede con el gen espC, localizado fuera del LEE, el cual codifica para un proteína autotransportadora que tiene actividad citotóxica), ha permitido identificar motivos reguladores que se conservan en algunos de ellos y que parecen definir un regulón en el que se agrupan varios genes nle. Uno de estos motivos ha permitido, a su vez, identificar otros genes que potencialmente codifican para proteínas secretadas por el SSTT previamente no identificados. Así mismo, se está analizando el proceso de secreción y translocación de algunos de estos efectores (como NleG y NleH) y el papel que juegan durante la infección aprovechando el modelo Citrobacter-ratón. Estamos también definiendo el mecanismo por el cual las proteínas del LEE, SepL y SepD, determinan el orden espacial y temporal en el que son secretadas las proteínas que constituyen el translocón del SSTT, los efectores del LEE o los efectores codificados fuera del LEE. Estas dos proteínas forman un "switch" molecular que permite la secreción de las proteínas translocadoras como EspA, a la vez que bloquean la secreción de las efectoras como Tir, NleA, etc. La disminución del calcio extracelular favorece la secreción de proteínas efectoras, sugiriendo que la jerarquía de la secreción a través del SSTT se establece en respuesta a señales ambientales que podrían determinar su funcionamiento durante la infección. EPEC, a diferencia de otros organismos A/E, posee el operón per, el cual está contenido en el plásmido EAF, que también codifica para la fimbria BFP. Este operón codifica para las proteínas PerA, PerB y PerC. PerA regula la producción de la fimbria BFP a través de la activación de los genes bfpA y perA. Dicha regulación involucra el reconocimiento de una secuencia conservada en la región reguladora de ambos genes, así como interacciones con la subunidad alfa de la RNA polimerasa. Actualmente, se definen motivos funcionales en PerA para extender el conocimiento sobre su mecanismo de acción. Por su parte PerC activa la expresión del gen ler, dando lugar a una cascada reguladora dependiente de PerA ya que éste autorregula la expresión del operón per. En EPEC PerC y GrlA tienen una función redundante en la activación de ler, pero no en las mismas condiciones de crecimiento, lo cual sugiere que podrían actuar durante diferentes etapas de la infección. El modo de acción de estos dos reguladores está siendo estudiado.

Las fimbrias o pili son importantes factores de colonización para E. coli, ya que participan en la interacción de la bacteria con las células del huésped. Los genomas de EHEC y EPEC poseen 16 operones que potencialmente codifican para la síntesis de este tipo de estructuras, pero sólo en algunos casos se ha observado su expresión y en general no se conoce su papel en virulencia. En estrecha colaboración con el grupo del Dr. Jorge Girón de la Universidad de Arizona, nuestro grupo también se ha interesado en el estudio de los mecanismos que regulan la expresión de algunos de estos operones como ecp (E. coli common pili) y hcp (Hemorrhagic coli pili) y de las condiciones donde podrían ser expresados durante una infección, así como en el estudio de la biogénesis, estructura y papel en la virulencia de diferentes patotipos de E. coli. Salmonella enterica, agente causal de la salmonelosis o de infecciones sistémicas como la f iebre tifoidea, posee dos islas de patogenicidad denominadas SPI1 y SPI2 ("Salmonella pathogenicity island"). Cada una codifica para un SSTT y proteínas efectoras que son necesarias para que Salmonella invada células epiteliales y sobreviva intracelularmente en macrófagos, respectivamente. En la isla SPI5 están presentes tanto genes regulados por el regulón de la SPI1 como de la SPI2, cuyos productos son secretados por los respectivos SSTT. A través del estudio de la regulación transcripcional de los componentes de estas islas, estamos analizando los mecanismos moleculares que permiten a Salmonella efectuar los cambios transcripcionales necesarios para pasar de la fase invasiva mediada por SPI1, a la de patógeno intracelular que da lugar a la infección sistémica mediada por SPI2. A la fecha, ha sido interesante definir que algunos reguladores que se pensaba específico de la SPI1, están involucrados en establecer un mecanismo de "cross-talk" entre las islas SPI1 y SPI2, el cual podría mediar la transición transcripcional entre las dos islas durante el paso de Salmonella a la vida intracelular Las protenas reguladoras SirA y HilD son importantes componentes de esta cascada reguladora en Salmonella, as como modelos de estudio en nuestro grupo..





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