Instituto de Biotecnologia UNAM

Dr. Guillermo Gosset Lagarda

Nuestro grupo está interesado en el estudio de la fisiología microbiana y la aplicación del conocimiento generado al desarrollo de nuevas y mejores tecnologías biológicas. Tomando como modelos principales a las bacterias Escherichia coli y Bacillus subtilis , realizamos estudios que nos están ayudando a entender los procesos celulares relacionados al transporte de fuentes de carbono, el metabolismo central, las vías de síntesis de compuestos aromáticos y la resistencia a diferentes tipos de estrés. Con base en estos estudios, se han desarrollando cepas modificadas mediante ingeniería de vías metabólicas y procesos fermentativos para la producción de varios compuestos de interés industrial. Los compuestos aromáticos son una clase de productos químicos con aplicaciones en varias áreas de la industria. Actualmente la mayoría de estos compuestos son producidos mediante síntesis química a partir del petróleo como materia prima. Nuestro grupo desde hace ya varios años ha aplicado las herramientas de la ingeniería metabólica para generar cepas de E. coli con la capacidad de producir compuestos aromáticos con un alto rendimiento a partir de glucosa. Durante los dos últimos años hemos enfocado nuestro esfuerzo a la generación de cepas de E. coli con la capacidad de producir el aminoácido aromático L-tirosina (L-Tir). Este aminoácido se emplea en la alimentación humana y como precursor para la síntesis de otros compuestos de interés industrial. Con el propósito de lograr canalizar carbono de la vía común de síntesis de compuestos aromáticos hacia la vía específica de síntesis de L-Tir, fue necesario eliminar la regulación alostérica existente en la enzima que cataliza los primeros dos pasos de la vía. La enzima bifuncional corismato mutasa/prefenato deshidrogenasa (CM/PDH), codificada por el gen tyrA, cataliza los dos primeros pasos en la vía específica de síntesis de L-Tir. La actividad de esta enzima es inhibida por L-Tir. Para incrementar el flujo en la vía hacia L-Tir es necesario eliminar la inhibición ejercida por este aminoácido sobre la CM/PDH. Esto se logró mutagenizando al azar la región de tyrA que codifica para la actividad PDH. Las variantes obtenidas fueron seleccionadas por complementación funcional en una cepa de E. coli tyrA- pheA-. Varias de las mutantes obtenidas han sido caracterizadas, encontrándose que tres de ellas muestran resistencia parcial a inhibición por L-Tir. Estás mutantes serán expresadas en cepas de E. coli que poseen otras modificaciones para dirigir flujo de carbono hacia la vía común de síntesis de compuestos aromáticos y se determinará la capacidad de producción de L-Tir en las cepas resultantes. Una estrategia alternativa consistió en expresar enzimas de la vía de síntesis de L-Tir que naturalmente fueran insensibles a inhibición alostérica. Esto se logró expresando simultáneamente en E. coli los genes que codifican para el dominio de corismato mutasa de la enzima nativa corismato mutasa/prefenato deshidratasa y la enzima ciclohexadienil deshidrogenasa de Zymomonas mobilis. Esta construcción genética fue introducida a una cepa de E. coli modificada para dirigir flujo de carbono hacia la vía común de síntesis de compuestos aromáticos. En cultivos en fermentador con esta cepa se produjeron 3 g/L de L-Tir con un rendimiento de 66 mg L-Tir/g glucosa.

Nuestro grupo también tiene el interés en el desarrollo de cepas microbianas para la generación de compuestos del metabolismo fermentativo. Uno de nuestros objetivos fue obtener cepas derivadas de B. subtilis que pudieran utilizar glucosa o xilosa para producir mayoritariamente etanol o L-lactato. Primeramente se abordó la producción de etanol por B. subtilis a partir de glucosa. Después se abordó la producción de L-lactato a partir de glucosa o celobiosa usando a B. subtilis y finalmente, se siguió con la utilización de xilosa por B. subtilis en condiciones aireadas y no aireadas. B. subtilis es una bacteria Gram-positiva que puede fermentar glucosa en medio Luria-Bertani y producir mayoritariamente L-lactato y, en menor cantidad, 2,3-butanodiol y no produce ácido acético o etanol. Llevando a cabo ingeniería de vías metabólicas se modificó el metabolismo de B. subtilis para producir etanol, por medio de la expresión heteróloga de una vía etanologénica tomada de Z. mobilis (una bacteria aislada del pulque), e interrumpiendo las vías productoras de L-lactato y butanodiol (que compiten fuertemente por el piruvato disponible). Los resultados de este trabajo permitieron dilucidar un nuevo rol metabólico de la enzima lactato deshidrogenasa de B. subtilis, el cual consiste en mantener el equilibrio redox NADPH/NADP+ a través de la oxidación del cofactor NADPH. Con base en estos resultados se incluyó una nueva variable en el metabolismo de B. subtilis expresando la transhidrogenasa soluble de E. coli, para tratar de restablecer el desequilibrio NADPH/NADP+ generado por la interrupción de la lactato deshidrogenasa, así se obtuvo una cepa derivada de B. subtilis que produce etanol como producto único a partir glucosa, tanto los rendimientos como las productividades de etanol fueron las más altas obtenidas en cultivos lote para este tipo de bacteria. Por otro lado, se demostró que B. subtilis puede fermentar celobiosa produciendo L-lactato con alta pureza óptica, y que además puede fermentar altas concentraciones de glucosa obteniendo títulos de L-lactato mayores a 100 g/L en medio rico, debido a que además del azúcar B. subtilis puede dirigir esqueletos de carbono del medio de cultivo hacia la producción de L-lactato. De la literatura se conoce que a pesar de que B. subtilis cuenta con las enzimas necesarias para llevar a cabo el metabolismo de la xilosa, no puede utilizarla como única fuente de carbono debido a que no cuenta con un transportador específico para introducirla. Por esto, se obtuvieron cepas derivadas de B. subtilis que ahora pueden consumir xilosa como única fuente de carbono tanto en condiciones aeróbicas como fermentativas, por la expresión de un transportador inespecífico para xilosa o por la selección de mutantes que pueden crecer en medio mineral suplementado con xilosa. En condiciones aireadas B. subtilis pudo crecer mediante el consumo de la pentosa o la glucosa, en tanto que en condiciones de fermentación produjo L-lactato, en estas condiciones B. subtilis mostró una deficiencia en el transporte de glucosa.





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