Entender la reproducción impacta no solo a la fisiología y la salud humana, si no a la ganadería y la pesca. El diálogo entre gametos es clave para que ocurra la fecundación e involucra la regulación de su permeabilidad iónica. Los canales iónicos participan importantemente en la movilidad, maduración e inducción de la reacción acrosomal (RA) del espermatozoide. El espermatozoide es sujeto de renovado interés en la fisiología celular por su fundamental función. Entender los parámetros que afectan su movilidad es clave para comprender como ocurre la fecundación. La capa de gelatina que rodea al óvulo de erizos de mar Strongylocentrotus purpuratus contiene al speract, un decapéptido que modula la movilidad del espermatozoide. Actualmente se acepta que la unión del speract a su receptor(es) activa una guanilato ciclasa (GC) transitoriamente. El aumento en el GMPc activa canales de K+ regulados por GMPc que hacen más negativo el potencial de membrana (Em) del espermatozoide. Esta hiperpolarización temporal estimula a: un intercambiador Na⁺/Ca²⁺ que mantiene baja la concentración intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]i), un intercambio Na⁺/H+, la adenilato ciclasa (AC) y posiblemente un canal catiónico llamado SpHCN. Posteriormente el Em se repolariza y luego se depolariza resultando en aumentos en: el pH intracelular (pHi), la [Ca²⁺]i, el AMPc y la [Na⁺]i. Se sabe que la [Ca²⁺]i está íntimamente relacionada con la forma en la que bate el flagelo. Nosotros mostramos por primera vez que el speract induce fluctuaciones en el [Ca²⁺]i en espermatozoides individuales. Propusimos que estas fluctuaciones regulan como nada el espermatozoide. Nuestro sistema experimental mejorado de adquisición y análisis de imágenes para medir [Ca²⁺]i en espermatozoides individuales nadando nos permite registrar simultáneamente su trayectoria, la forma del flagelo y su concentración local de [Ca²⁺]i. Hasta hace poco Arbacia punctulata era la única especie de erizo de mar en la que se había demostrado quimiotaxis. Los espermatozoides de Strongylocentrotus purpuratus no experimentan quimiotaxis bajo condiciones experimentales equivalentes, aunque el patrón de movimiento inducido por los SAPs es muy parecido. En este periodo comparamos los espermatozoides de S. purpuratus y Lytechinus pictus que responden al speract. Desarrollamos un sistema de microscopía de fluorescencia que permite generar gradientes de speract casi instantáneamente empleando una versión enjaulada de este y usando cables ópticos de diferentes diámetros (0.26 mm). Encontramos que la presencia de un gradiente de sperat induce incrementos en la [Ca²⁺]i regulados en tiempo y espacio que desencadenan una respuesta quimiotáctica en los espermatozoides de L. pictus. Investigamos si las diferencias que determinan que un espermatozoide experimente quimiotaxis, o no, se originan en cambios en la relación entre la dinámica de los cambios en la [Ca²⁺]i durante las vueltas. Utilizamos ácido niflúmico, un bloqueador de canales de Cl^- regulados por Ca²⁺ que altera la cinética de las fluctuaciones en la [Ca²⁺]i, para examinar esta hipótesis. Encontramos que en su presencia los espermatozoides de L. pictus pierden la respuesta quimiotáctica. La caracterización de la regulación fina de la dinámica de Ca²⁺ y sus implicaciones en la movilidad, proporcionará evidencia de los mecanismos que regulan y dirigen la respuesta quimiotáctica. Entender los mecanismos moleculares que gobiernan la movilidad y su relación con el [Ca²⁺]i permitirá comprender mejor la fisiología del espermatozoide y en general como el Ca²⁺ regula a los flagelos y cilios de las células. Ahora se sabe que la mayoría de los tipos celulares tiene al menos un cilio o un flagelo cuya estructura está muy conservada. En el ratón y algunos otros mamíferos, la capacitación, un proceso de maduración del espermatozoide que ocurre en el tracto genital femenino que lo prepara para fecundar exitosamente al óvulo, aumenta el [Ca²⁺]i, el pHi, el potencial de membrana se hiperpolariza y varias proteínas se fosforilan en tirosinas. Varios canales parecen contribuir a dicha hiperpolarización.

Durante este año usando herramientas moleculares, inmunológicas y funcionales documentamos la presencia en el espermatozoide de ratón y humano de nuevos miembros de la familia de canales TRP, TRPV1 y TRPM8. Por otro lado demostramos que el Cl^- es importante para la capacitación, la RA y la fecundación. Establecimos la presencia de un canal de Cl^- CFTR en los espermatozoides de estas especies y que este parece regular a los ENaCs. La fosforilación que ocurre durante la capacitación depende de aumentos en la concentración de AMPc, sintetizada por una adenilato ciclasa soluble dependiente de HCO3-. El aumento en la concentración de HCO3-, y del pHi son muy importantes para completar la capacitación. Las concentraciones intracelulares de Cl^- ([Cl^-]i) y HCO3- están íntimamente relacionadas ya que el transporte de estos iones en muchos casos es interdependiente. Además, encontramos que la fosforilación en tirosinas depende del Cl^- extracelular y que durante la capacitación aumenta [Cl^-]i. Este año estudiamos a los intercambiadores de la familia Slc26 dado que en tejidos como el páncreas y el riñón interaccionan tanto con el CFTR como con el ENaC regulando la homeostasis del Cl^- y del HCO3-. Quizá hay un mecanismo de regulación similar en el espermatozoide ya que los canales CFTR y ENaC están en esta célula. Hasta ahora detectamos por Western Blot a los intercambiadores Slc26a3 y Slc26a6 en extractos de espermatozoides de ratón y mediante inmunocitoquímica vimos que se localizan en la pieza media, co-localizando con los canales ENaC y CFTR. Usando una estrategia recientemente publicada en la que se sella un electrodo de patch clamp en la "gota citoplásmica", es posible registrar corrientes macroscópicas en espermatozoides inmaduros. A pesar de ser una estructura residual que se eliminará, la gota citoplásmica está en continuidad eléctrica con el espermatozoide completo. Usando esta nueva estrategia confirmamos que el espermatozoide testicular de ratón expresa funcionalmente, además de canales Cav tipo T, ENaCs, KATPs y Slo1. Comparando las propiedades de Slo3 expresado heterologamente con las corrientes de este tipo en el espermatozoide, obtuvimos evidencia de la presencia funcional del canal Slo3 en esta célula. El inductor natural de la reacción acrosomal (RA) es la ZP3, una glicoproteína de la matriz externa del óvulo que activa, entre otras cosas, una entrada de Ca²⁺ dependiente de Ca²⁺ externo que es necesaria para que ocurra la RA. Esta entrada de Ca²⁺ tiene al menos dos componentes, uno transitorio (mseg) y el otro sostenido (min). Existe evidencia de que la entrada sostenida de Ca²⁺ esta mediada por canales operados por pozas internas (SOCs). El bloqueo de los SOCs inhibe la RA. Sin embargo, el mecanismo y la identidad molecular de estos canales no están bien definidos. Ahora sabemos que los SOCs están compuestos por dos familias de proteínas transmembranales, STIM (con dos miembros) y Orai (con tres miembros). STIM1 actúa como un sensor de Ca²⁺ del retículo endoplásmico (RE) y/o como activador de Orai, el cual constituye el propio canal que, al activarse, permiten una entrada altamente selectiva a Ca²⁺, no activada por voltaje, denominada ICRAC (release activated calcium current) en células no excitables. En el espermatozoide de ratón detectamos STIM1, STIM2, Orai1 mediante RT-PCR en células espermatogénicas y mediante Western Blot confirmamos la presencia de las proteíans STIM1, STIM2 y Orai3 e iniciamos estudios de su localización subcelular.