Instituto de Biotecnologia UNAM

Grupo de la Dra. Maria Alejandra Bravo

Las líneas de investigación que se desarrollan en nuestro laboratorio se centran en los estudios sobre las proteínas insecticidas producidas por la bacteria Bacillus thuringiensis. El principal objetivo del grupo es entender el mecanismo de acción de las proteínas Cry tomando en cuenta aspectos como es el estudio de la activación de las toxinas, el proceso de oligomerización para la formación de un pre-poro competente en la inserción en la membrana; el análisis de los cambios estructurales de la toxina cuando se inserta en la membrana; el estudio de la participación de los microdominios de membrana y la respuesta intracelular en la actividad de las toxinas; el mecanismo molecular del sinergismo entre toxinas Cry y Cyt, los estudios de formación de poro de diferentes toxinas Cry en membranas sintéticas y en membranas del insecto, las deleciones en el extremo amino-terminal que permiten oligomerizan en ausencia del receptor caderina y matar insectos resistentes que carecen de caderina, el análisis de unión de toxinas a membranas de insectos resistentes a las toxinas Cry y la generación de plantas transgénicas que expresan diferentes modificaciones de las toxinas Cry.

Desde 1996 hemos trabajado en estrecha colaboración con el grupo del Dr. Mario Soberón, quien además se ha concentrado en la descripción de las bases moleculares de la especificidad de estas toxinas. Analizando los epítopes de interacción con los diferentes receptores así como la identificación de receptores en diferentes insectos plaga. Es fácil entender que el trabajo del grupo del Dr. Mario Soberón y el nuestro es mutuamente dependiente y complementario. En 2004 publicamos un modelo del mecanismo de acción de las toxinas Cry1A en lepidópteros basado en datos de nuestros laboratorios. En este modelo propusimos que estas toxinas interaccionan de manera secuencial con dos receptores, caderina y aminopeptidasa (APN). Propusimos que el primer contacto con caderina genera un cambio conformacional de la toxina que conduce a un corte proteolítico del extremo amino terminal. El corte de hélice alfa-1 induce la oligomerización de la toxina en una arreglo de 250 kDa, posiblemente un tetrámero. La toxina en conformación de oligómero incrementa su afinidad por APN, la cual esta anclada a la membrana por un puente de GPI y es la encargada de conducir al oligómero a los microdominios de membrana en donde se inserta formando un poro iónico que causa la muerte de las células. En ese momento propusimos que el conocimiento a nivel molecular de como matan estas toxinas sentaría las bases para en un futuro diseñar toxinas más potentes con espectros de acción diferentes ó que sean capaces de sobrellevar el problema de resistencia. En febrero 2005 generamos toxinas modificadas que carecían de hélice alfa-1 con la idea de tener una mutante que genere eficientemente la estructura oligomérica sin necesidad del contacto con el primer receptor, que nos permitiera tener grandes cantidades del oligómero en solución para estudios estructurales y funcionales. Estas toxinas mutantes podrian ser utilizadas para matar a los insectos resistentes que carecen del receptor caderina. Establecimos la colaboración con Dr. Tabashnik, le enviamos toxinas modificadas que fueron probadas contra insectos de Pectinophora gossypiella (principal plaga en algodón), resistentes a toxinas Cry1Ab y Cry1Ac. El resultado fue sorprendente mostrando total perdida de resistencia a las toxinas Cry. Al mismo tiempo silenciamos la expresión de caderina en larvas de Manduca sexta utilizando dsRNAi, demostramos que las larvas no expresan caderina, se vuelven resistentes a toxinas Cry1A pero sensibles a toxinas modificadas sin hélice alfa-1.

Hemos comenzado a probar estas toxinas modificadas contra otros insectos resistentes como Plutella xylostella, Trichoplusia ni, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Diatraea sacharalis y Ostrinia nubilalis , en donde también se abatió la resistencia. Por otro lado, estamos mapeando el corte de hélice alfa-1 para encontrar la condición en donde se genere la toxina más estable, con mayor toxicidad y estamos modificando otras toxinas como las activas contra mosquitos y contra coleopteros. Hemos iniciado un estudio sobre la unión de las toxinas modificadas a los receptores presentes en insectos sensibles y resistentes a toxinas Cry nativas. Nos interesa continuar nuestros estudios estructurales y funcionales de la inserción de toxinas Cry en membrana utilizando análisis de espectroscopia de fluorescencia, microscopía electrónica y electrofisiología. Hemos analizado los cambios estructurales en formas monoméricas y oligoméricas de la toxina inducidos por calor y por agentes caotrópicos combinado con proteolisis parcial, así como cambios conformacionales por interacción con receptor APN. En estos estudios demostramos que el dominio I esta más estructurado, es el que se inserta en membrana y que la interacción con APN induce una estructura más flexible capaz de insertarse en membrana. Otros proyectos se enfocan a describir el proceso de oligomerización de las toxinas Cry1A y Cry11A. Tenemos mutantes puntuales que afectan este proceso que nos permiten identificar algunas regiones de la toxina involucradas en oligomerización. Hemos optimizado este proceso y nuestros datos apuntan a la importancia de generar una estructura parcialmente desnaturalizada, tipo moltenglobe, la cual se obtiene por pH alcalino. Tenemos ahora arreglos paracristalinos que nos permitirán hacer un análisis de microscopía electrónica sobre el arreglo estructural de la toxina en el estado oligomérico en solución y también insertado a membrana. Finalmente hemos iniciado un proyecto muy ambicioso sobre el análisis proteómico en mosquitos disparado por efecto de las toxinas Cry que nos permitirá iniciar una nueva área sobre la respuesta intracelular a las toxinas Cry. Nos interesa iniciar el análisis de la respuesta intracelular a las toxinas Cry. Estamos convencidos que el estudio a detalle del modo d e acción de estas toxinas insecticidas resultara en el desarrollo de nuevos y novedosos productos para el control de insectos plaga y vectores de enfermedades. Las toxinas modificadas son solo el primer ejemplo.

Dra. Maria Alejandra Bravo
Investigador
Tutor de Maestría y Doctorado
Dr. Marco Aurelio Diaz
Investigador en estancia temporal
Biól Jorge Felix Sanchez
Técnico Académico
Lic. Blanca Lizbeth Cabrera.
Servicios profesionales
Biol. Nathalia Dos Santos
Estudiante
Lic. Carlos Espindola
Estudiante
Lic. Vianca Alicia López
Estudiante
Biol. Daniela Lizeth Martinez
Estudiante
M.C. Violeta Matus
Estudiante
M.B Mary Carmen Torres
Estudiante
M.C. Cristina Macedo
Estancia Temporal


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